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RNA干擾（RNAi）是指在進(jìn)化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（dsRNA）誘發(fā)的同源mRNA特異性降解的現(xiàn)象。近幾年來RNAi研究取得了突破性進(jìn)展，由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá)，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。2018年伊始，《PNAS》連發(fā)兩論文一綜述，讓RNAi的研究更加如火如荼。 |
呈遞問題的解決
在RNAi過程中，特殊的酶能將RNA切成小片段（siRNA或miRNA），并與特殊的蛋白（Argonaute蛋白，尤其是Argonaute 2（Ago2）蛋白）相結(jié)合，從而抑制靶向信使RNA翻譯。siRNA藥物可以在特定基因水平上起作用，可以遞送到胞質(zhì)溶膠中，并且不需要運輸?shù)郊?xì)胞核中或與染色體DNA相互作用。然而，正如其他DNA和RNA候選藥物一樣，siRNA藥物也正面臨著無法進(jìn)行有效呈遞的問題。這些大分子會被體液中的核酸酶迅速降解，并且經(jīng)歷腎臟和肝臟的快速清除，嚴(yán)重的有可能引發(fā)不利的先天性免疫反應(yīng)，想要提高siRNA藥物的療效和安全性，首要解決的就是呈遞問題。
Jiahe Li帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊借助不同的傳遞載體，以RNAi的中央效應(yīng)蛋白Argonaute 2（Ago2）為平臺增強(qiáng)RNAi。他們發(fā)現(xiàn)siRNA和Ago2之間的物理聚集對于RNAi的增強(qiáng)*。同時他們還發(fā)現(xiàn)某些聚胺可調(diào)節(jié)siRNA / Ago2介導(dǎo)的RNA，他們借此使致癌基因STAT3沉默并顯著延長了黑素瘤小鼠的存活率。該研究結(jié)果以《Structurally modulated codelivery of siRNA and Argonaute 2 for enhanced RNA interference》為題發(fā)表于2月5日的《PNAS》上。
siRNA / Ago2進(jìn)入細(xì)胞示意圖
Li等將雙鏈siRNA和Ago2蛋白包裝到具有相同骨架但聚乙烯二胺重復(fù)不同的聚胺的陽離子側(cè)基上。研究人員發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物細(xì)胞中，與其他三種Argonaute蛋白相比，Ago2顯得更為重要。在RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物形成和mRNA翻譯時，siRNA的載體鏈被切割并從Ago2分離，而反義siRNA鏈加載的Ago2卻可持續(xù)識別并切割靶mRNA。這項研究結(jié)果為改進(jìn)RNAi技術(shù)功效提供了新方法。
siRNA / Ago2引起的基因沉默
siRNA / Ago2聚胺引起的基因沉默
研究人員對聚胺合成的呈遞載體的設(shè)計參數(shù)和由此產(chǎn)生的siRNA / Ago2的基因沉默效率進(jìn)行了研究，并合成了一系列衍生自L-天冬氨酸芐酯骨架和N-羧酸酐的聚合物，這種聚合物主鏈已被證明是相對安全的，側(cè)鏈為多胺結(jié)構(gòu)，這些適當(dāng)?shù)膫?cè)鏈操作不僅實現(xiàn)了率呈遞，還阻止了負(fù)面影響的產(chǎn)生。這些研究表明，再編碼的Ago2在基因沉默中發(fā)揮的重要作用，可以以不同的方式調(diào)節(jié)基因。盡管這些影響目前歸因于聚合物和siRNA以及Ago2之間的物理作用，但是這些研究結(jié)果將引導(dǎo)科學(xué)家對納米級效應(yīng)機(jī)制的詳細(xì)研究，并對siRNA在體內(nèi)穩(wěn)定性的研究會有所幫助。另外，研究人員發(fā)現(xiàn)優(yōu)化的多胺/抗STAT3 siRNA / Ago2復(fù)合物可使腫瘤負(fù)荷降低并使小鼠存活率改善，這表明結(jié)構(gòu)優(yōu)化的siRNA / Ago2具有治療的潛力。
多胺側(cè)鏈結(jié)構(gòu)穩(wěn)定了siRNA和Ago2之間的納米級相互作用
特異性問題的解決
雖然CRISPR技術(shù)能夠達(dá)到*改造基因的效果，但在許多疾病中沉默基因會建立短期效應(yīng)，其在mRNA水平上的基因表達(dá)無法*阻斷，還會減少相應(yīng)的目標(biāo)效應(yīng)。想要準(zhǔn)確識別這些短期效應(yīng)，就需要具有*特異性的工具，解決RNAi技術(shù)的特異性問題已經(jīng)迫在眉睫。
在3月12日一篇題為《Programmable RNA recognition using a CRISPR-associated Argonaute》的文章中，Audrone Lapinaite等人將焦點聚集于Argonaute（Ago） 蛋白上。研究人員發(fā)現(xiàn)，使用5-溴-2'-脫氧尿苷（BrdU）體外重建的CRISPR相關(guān)的Ago復(fù)合物Marinitoga piezophila Argonaute-gRNA（MpAgo RNP）可顯著增強(qiáng)其對RNA靶標(biāo)的特異性和親和力。他們借此繪制了gRNA的種子區(qū)域，并鑒定出決定其靶向特異性的gRNA的核苷酸。
在一些細(xì)菌中，Agos與CRISPR基因座相關(guān)，并使用非經(jīng)典的5'-羥基化的指導(dǎo)RNA（gRNA）進(jìn)行核酸靶向。研究人員發(fā)現(xiàn)MpAgo很容易用gRNA編程來形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物（RNP）。重建的MpAgo RNPs只能以中等的親和力和特異性結(jié)合*互補(bǔ)的RNA底物，在gRNA的5'末端摻入5-溴-2'-脫氧尿苷（BrdU）后，使MpAgo RNP快速穩(wěn)定，并大大提高了MpAgo RNP的親和力和特異性。此外，具有5'-BrdU gRNA的MpAgo RNP可選擇性結(jié)合僅相差一個核苷酸的底物，實現(xiàn)了從復(fù)雜的混合物中分離出肌苷編輯的RNA底物。這些發(fā)現(xiàn)拓寬了研究人員對Ago與底物RNA相互作用的機(jī)理理解，并證明MpAgo RNP可以用作高度特異性的RNA靶向平臺來研究RNA。
具有5'-BrdU gRNA的MpAgo RNP特異性結(jié)合ssRNA
gRNA的種子區(qū)域
另外，研究人員測試了gRNA的5'端核苷酸是否影響MpAgo RNP結(jié)合和切割RNA的能力。他們使用與gRNA*互補(bǔ)或非互補(bǔ)的RNA底物，檢查了gRNA的5'-末端核苷酸是否影響體外ssRNA亞基結(jié)合效率和特異性。研究結(jié)果表明切割不需要ssRNA底物的緊密結(jié)合，gRNA的5'端核苷酸也不影響MpAgo RNP的結(jié)合能力。他們借此繪制了gRNA的種子區(qū)域，并鑒定出決定其靶向特異性的gRNA的核苷酸，順利解決了RNAi療法的特異性問題。
3月16日，Rangaramanujam M. Kannan發(fā)表了題為《Toward new design principles for superior gene silencing》的綜述，對上述研究做了相應(yīng)分析。文中指出，通過明確的設(shè)計原則，改進(jìn)的siRNA包裝，可以有效解決siRNA的呈遞和Ago蛋白的特異性問題，為RNAi療法開辟新的途徑，從而實現(xiàn)個性化的藥物。
參考資料：
1. Structurally modulated codelivery of siRNA and Argonaute 2 for enhanced RNA interference
2. Programmable RNA recognition using a CRISPR-associated Argonaute
3. Toward new design principles for superior gene silencing
13916499749
